植物细胞的生长与分化研究（论文4种基因表达量和光合参数差异对白桦无性系幼苗生长的影响）

论文4种基因表达量和光合参数差异对白桦无性系幼苗生长的影响原创纳晓莹等南京林业大学学报论文推荐4种基因表达量和光合参数差异对白桦无性系幼苗生长的影响纳晓莹，刘刚，刘桂丰，王秀伟*东北林业大学森林生态系统可持续经营教育部重点实验室，东北林业大学林学院白桦(Be。

原创纳晓莹等南京林业大学学报

论文推荐

4种基因表达量和光合参数差异对白桦无性系幼苗生长的影响

纳晓莹，刘刚，刘桂丰，王秀伟*

东北林业大学森林生态系统可持续经营教育部重点实验室，东北林业大学林学院。

白桦(Betula platyphylla Suk.)广泛分布于我国东北以及华北等地区,具有速生、耐严寒、适应性强等特征,是我国人工林的主要树种之一。近年来,提高白桦的光合能力,进而提升白桦人工林的造林质量,产生更大的社会、生态和经济价值是研究热点。植物的生物量和生物产量主要取决于光合作用,影响植物光合效率的因素很多,有研究表明,植物缺乏磷元素会使光合磷酸化过程中有机磷循环受阻从而降低光合速率;也有人认为，提高光合作用效率的关键之一是增强与光合作用相关的酶的催化效率。如,核酮糖-1 ,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)催化光合作用中暗反应的第一步,但是其催化效率却很低,而植物为了弥补Rubisco较低的催化效率,会大量积累Rubisco于细胞内,使其含量占植物细胞内可溶性蛋白的20% ~50%,但这也大大降低了植物对氮素的利用效率。

由于酶在光合作用暗反应阶段发挥了重要的作用,因此,笔者选取Rubisco、 Rubsico活化酶(RCA)和乙醇酸氧化酶(GO)3种酶作为研究对象。Rubisco负责对光合作用中CO₂的固定过程进行催化,此反应是光合作用中碳固定的关键步骤。RBCS多基因家族负责编码Rubisco的小亚基, RBCS1A、RBCS3B是RBCS多基因家族两个主要成员。RCA负责对叶片内的Rubisco进行活化, Rubisco只有经过活化才能表现出其羧化/加氧活性,即Rubisco在植物体内的活性取决于RCA对它的活化作用。GO在植物光呼吸过程中负责将乙醇酸氧化成乙醛酸,虽然GO与碳固定的相关性可能不高,但是由于其参与催化光合作用的光呼吸过程,因此选择GO作为对照基因,探索GO与光合速率的关系。

本期论文推荐的作者采用标准化实验方法,测定6组不同1年生白桦无性系幼苗的苗高和地径、4种特定基因(RBCS1A、RBCS3B、RCA、GO)相对表达量以及6种光合作用参数(净光合速率、胞间CO₂浓度、瞬时水分利用效率、气孔导度、羧化效率、蒸腾速率),比较无性系间生长量的差异,并分析两个生长量参数(苗高、地径)与基因表达量和光合参数间的相关性,以期找出对白桦幼苗生长有影响的相关因素，为我国白桦幼苗培育技术提供理论依据。

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作者简介

通讯作者

王秀伟，男，1981年生，东北林业大学林学院教授，博士生导师，主要研究方向为树木生理学和植物生态学研究生。

第一作者

纳晓莹，女，1990年生，东北林业大学林学院林木遗传育种专业硕士研究生。

关键词：白桦无性系；幼苗；生长量；基因表达量；光合参数

基金项目：国家自然科学基金项目(31670476) ;黑龙江省应用技术研究与开发计划项目(GA20B401);中央高校基本科研业务费专项( 2572019BA15,2572019CP09)。

引文格式：纳晓莹,刘刚,刘桂丰,等.4种基因表达量和光合参数差异对白桦无性系幼苗生长的影响[J].南京林业大学学报(自然科学版),2022,46(2):88-94.NA X Y ,LIU G,LIU G F , et al. Differences in the expression of four genes and photosynthetic parameters in seedlings of different birch clones and their effects on growth[J]. Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition),2022,46(2):88-94.DOI:10.12302/j.issn.1000-2006.202103037.

1目的

分析1年生白桦(Betula platyphylla)无性系幼苗RBCS1A、RBCS3B、GO、RCA基因表达量和光合速率、蒸腾速率、气孔导度、瞬时水分利用效率、胞间CO₂浓度、羧化效率与苗高、地径的相关性,探索基因表达量和光合参数对白桦无性系幼苗生长初期的影响。

2方法

在白桦双列杂交子代林中选择6株成熟的树木进行组织培养,随后将其扩繁为6个无性系,对1年生白桦无性系幼苗的生长量与光合参数和4个与光合作用相关的基因表达量进行测定分析。

2.1 试验材料

植物材料。从白桦双列杂交子代林中选择6株长势良好的树木进行组织培养获得的无性系幼苗。2014年5月1日,将幼苗移至室外设置的温室大棚中进行培养,2015年5月收获1年生白桦无性系幼苗,分别命名为3号、15号、21号、33号、52号、56号,在自然环境中适应1个月后测定相关参数。

实验试剂及引物合成。通用植物总RNA提取试剂盒(离心柱型, BioTeke , RP3002 ), RNASE RE-MOVER I(华越洋,0416),反转录试剂盒(TOYo-BO, FSQ-301 ) ,SYBR Green ( Realtime PCR MasterMix-Plus-TOYOBO , QPK-212)。实验中所用引物由金唯智生物工程股份有限公司合成。

实验仪器与软件。Eppendorf常温离心机(5424,德国)，Eppendorf低温离心机(5407,德国), IMPLEN超微量分光光度计(P330,德国),荧光定量PCR仪(ABI 7500,美国),便携式光合测量系统(Li-6400,LI-COR ,Nebraska,美国)等;7500Software v2.0.6 ( Applied Biosystems ,美国)， Office2010( Microsoft,美国),BD 8.10 软件(Premier ,加拿大),R 3.2.3等。

▲图中为测定白桦无性系幼苗的苗高

2.2 实验方法

1)光合指标的测定。于2015年6月9日上午9:00—10:0测定叶片的光合参数。每个白桦无性系选取3株生长正常的幼苗,每株选择2片完全伸展、长势良好的健康成熟叶片进行测量,重复3次。测定时人工光照的光合有效辐射为1 000 μmol/ (㎡.s)。测定指标分别为净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO₂浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr),同时计算瞬时水分利用效率(EWUE=Pn/Tr)和羧化效率(ECUE=Pn/Ci)。

2)总RNA 的提取和cDNA的合成。用通用植物总RNA提取试剂盒提取6株白桦无性系幼苗叶片的总 RNA;使用超微量分光光度计检测提取RNA的质量,确定 RNA的浓度;通过反转录试剂盒将总RNA反转录合成第一链cDNA ,并在﹣20 ℃条件下保存反应液。3)实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)。根据白桦基因组和转录组数据库中的数据设计目的基因定量引物和内参,为了确保引物的特异性,利用BLAST程序对引物进行比对,详细的引物信息见表1。

▼表 1 实时荧光定量PCR引物信息

分别以6株白桦无性系幼苗的叶片cDNA 为模版,每个无性系进行3次生物学重复,每个模版进行4次技术重复,实时荧光定量PCR反应采用SYBR Green法(反应体系包括超纯水4.4 μL、荧光染料SYBR10.0 μL、缓冲溶液2.0 μL、引物-F0.8 μL、引物-R0.8 μL、模板DNA2.0 μL) ,PCR具体反应程序见表2。荧光信号校正使用参比染料(ROX);荧光数据类型选择基线校正的标准化荧光值;采用Amplification-based threshold 对阈值进行计算;采用“Treat Collectively”算法对技术重复的数值进行合并;采用参比染料标准化的荧光值的一阶导数对溶解曲线进行分析;采用ΔΔCT法计算基因的相对表达量:

式中:ΔCTMZ表示目标株系目的基因与内参基因阈值循环数差值,CTM表示目的基因阈值循环数,CTN表示内参基因阈值循环数,CTGE表示目的基因相对表达量。荧光阈值设定为0.07(由扩增曲线结果得出),使用得到的样本CT对各相关参数进行计算。公共内参CT值为BpSAND和BpUBQ两个内参CT值的几何平均数。使用3号幼苗叶片的各基因表达量作为参考,计算各无性系幼苗叶片RBCS1A、RBCS3B、GO和RCA基因的相对表达量。

2.3 数据分析

使用R3.2.3进行数据分析和绘图。经检验，研究中所有变量值均符合正态分布。运用单因素方差分析和多重比较分析不同无性系间基因相对表达量和光合参数间的差异,采用Pearson相关性分析评价参数之间的二元相关性。

▼表 2 实时荧光定量PCR反应体系

3结果

6种不同基因型白桦无性系幼苗的生长量、光合参数及基因表达量间差异显著(P<0.05);光合参数间表现出了密切的相关性,其中净光合速率与瞬时水分利用效率、蒸腾速率、气孔导度、羧化效率显著正相关(P<0.05)。RBCS1A的表达量与RBCS3B显著正相关,RBCS1A的表达量与RCA显著正相关，GO基因的表达量与RCA显著负相关(P<0.05)。基因表达量与植物的蒸腾速率、净光合速率、瞬时水分利用效率及气孔导度间均表现出了显著相关性(P<0.05),但基因表达量和光合参数与白桦幼苗的苗高、地径相关性未达到显著水平(P>0.05)。

3.1 不同白桦无性系幼苗苗高、地径的差异

从不同白桦无性系生长情况(图1)可知,无性系间苗高(H)和地径(D)的差异显著(P<0.05) ,整体上,地径随着苗高的增加而增加;6种白桦无性系幼苗的苗高为85.38~123.39 cm,地径为5.73~7.56 mm;苗高从高到低排序为15号、33号、52号、3号、21号和56号,表现最优的是15号(123.39 cm),表现最差的是56号(85.38 cm);地径最大的是无性系3号(7.56 mm),最小的是无性系56号(5.73 mm)。

▲图 1 不同白桦无性系幼苗苗高、地径的差异比较

注：图中不同小写字母表示苗高或地径Duncan检验差异显著(P<0.05)。下同。

3.2 不同白桦无性系幼苗光合参数的差异

白桦无性系幼苗光合参数的差异见图2。由图2可以看出:无性系间Ci差异显著(P<0.05) ,Ci的变化范围为261.06~284.07 μmol/mol ,最高的是无性系21号,最低的是无性系33号;无性系间EWUE和ECUE表现出了显著的差异(P<0.05 )，EWUE最高的为无性系33号、最低的为21号,ECUE最高的为无性系33号和56号,显著高于其他无性系，最低的为无性系3号;不同无性系间Gs、Tr、Pn均存在显著差异(P<0.05) ,Gs较高的为无性系21号[0.26 μmol/(㎡·s)]和无性系56 号[0.28 μmol/ (㎡·s)]、最低的为无性系3号[0.15 μmol/(㎡·s)];T,最高的是无性系21号[7.09 mmol/(㎡.s)],显著高于其他的无性系,最低的是无性系3号[4.44 mmol/ (㎡·s)],显著低于无性系21号、56号以及15号;Pn较高的为无性系33号和56号[分别为14.37和14.97 μmol/ (㎡·s)],显著高于其他的无性系,最低的为无性系3号的 9.83 μmol/ (㎡·s) ,显著低于其他无性系。

▲图 2 不同白桦无性系幼苗净光合速率、气孔导度、胞间CO₂浓度、蒸腾速率、瞬时水分利用效率、羧化效率的差异

3.3 白桦无性系幼苗RBCS1A、RBCS3B、GO与RCA基因相对表达量的差异

不同白桦无性系幼苗RBCS1A、RBCS3B、GO与RCA基因相对表达量间存在显著差异(P<0.05)(图3)。所有的无性系中4种基因相对表达量以RCA的最高(除了56号),GO基因的最低(除了3号),且在无性系21号中RCA相对表达量最高、GO的相对表达量最低。就不同基因来看,RBCS1A的相对表达量在无性系21号、33号、56号中较高，15号中最低;RBCS3B的相对表达量在无性系33号、56号中较高,15号中最低;GO的相对表达量在无性系3号、33号中较高,且显著高于其他无性系,在21号中最低;RCA的相对表达量在无性系21号中最高,且显著高于其他无性系,在15号中最低。同时,基因RBCS1A和RBCS3B的相对表达量在不同白桦无性系幼苗中显示出了相同的变化趋势。而4种基因的总表达量中,33号的最高,15号的最低。

▲图 3 不同白桦无性系幼苗RBCS1A,RBCS3B,GO与RCA基因相对表达量的差异

3.4 白桦无性系幼苗基因相对表达量、光合参数与生长量之间的相关性分析

RBCS1A基因相对表达量与RCA基因相对表达量(R=0.920) 、RBCS3B基因相对表达量与RCA基因相对表达量(R=0.629)显著正相关(图4); GO基因相对表达量与RCA基因相对表达量(R=0.326)显著负相关;其他基因间没有表现出显著相关性。白桦无性系幼苗6个光合参数也表现出了显著的相关性,其中,Pn与Gs(R=0.736)、Tr(R=0.499)及ECUE(R=0.937)显著正相关;Gs与Ci(R=0.727)、Tr(R=0.818 )、ECUE(R=0.472)显著正相关;Ci与Tr显著正相关,与EWUE显著负相关;Tr与EWUE显著负相关,与ECUE显著正相关;EWUE与ECUE显著正相关。基因RBCS1A、RBCS3B的相对表达量与Pn、Tr显著正相关。植物的生长量参数(苗高、地径)与基因相对表达量及光合参数的相关性未达到显著水平(P>0.05)。